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細(xì)胞系(株)的鑒定方法
更新時(shí)間:2016-01-08   點(diǎn)擊次數(shù):5456次

 (一)形態(tài)學(xué)鑒定

1.光學(xué)顯微鏡檢查

(1)培養(yǎng)瓶(皿)或培養(yǎng)板直接置于倒置顯微鏡下觀察,上皮細(xì)胞呈多邊形,邊界清晰,大小規(guī)則,核呈圓形,核質(zhì)比例小,細(xì)胞間排列整齊,為單層培養(yǎng)物,無(wú)重疊生長(zhǎng),是正常上皮組織來(lái)源;成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,核小而圓,細(xì)胞排列規(guī)則、整齊,為單層培養(yǎng)物,無(wú)重疊生長(zhǎng),是正常間質(zhì)組織來(lái)源。腫瘤組織來(lái)源的貼壁細(xì)胞,其單層培養(yǎng)物呈多層重疊生長(zhǎng)。

(2)細(xì)胞染色檢查:將無(wú)菌小玻片(O.5cm×2cm)于細(xì)胞傳代接種前放人培養(yǎng)瓶皿內(nèi),接種細(xì)胞懸液后培養(yǎng),在玻片上制備培養(yǎng)的單層細(xì)胞,然后將載有細(xì)胞的玻片取出,用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffeer saline,PBS)輕輕漂洗后,將玻片放在普通玻片上,空氣中自然干燥。經(jīng)PBS/甲醇(1:1)固定液同定15min,棄固定液,加吉姆薩(Giemsa)染色液染色10~15min,用清水漂洗干凈,置于空氣中干燥,用二甲苯透明,用光學(xué)樹(shù)脂膠片封片后觀察。上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)與直接鏡檢相同,細(xì)胞核染成紫紅或藍(lán)紫色,胞質(zhì)染成粉紅色。

2.電子顯微鏡觀察通常用透射電鏡檢查細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰蛋白酶消化,加培養(yǎng)液懸浮消化的細(xì)胞,用1000r/min離心5min。收集離心管底部細(xì)胞,經(jīng)戊二醛固定,包埋,超薄切片;也可采用細(xì)胞原位包埋的方法,將細(xì)胞培養(yǎng)于電鏡用特殊膜上,進(jìn)行固定,包埋,該法不破壞細(xì)胞問(wèn)排列關(guān)系。在電鏡下可見(jiàn)到上皮細(xì)胞的張力原纖維和橋粒等,腺細(xì)胞可見(jiàn)胞質(zhì)中的分泌顆粒,這對(duì)確定培養(yǎng)細(xì)胞系組織來(lái)源有重要意義。

(二)細(xì)胞核型分析

    細(xì)胞染色體核型分析能簡(jiǎn)易、有效地確定細(xì)胞種來(lái)源和鑒定正常或惡性的性質(zhì),以及檢查細(xì)胞有無(wú)交叉污染等。細(xì)胞染色體核型分析包括制備中期細(xì)胞分裂象樣本,將分散的單個(gè)染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)和排列分組分析。

1.制備細(xì)胞分裂樣本取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液,加入1×1 0-5 mol/L秋水仙素(終濃度為1×10-7mol/L)到養(yǎng)液中,處理6h后,輕輕吸出培養(yǎng)液,加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞或手振搖培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落,收集中期分裂象細(xì)胞,37℃靜置20min后加入冰醋酸一甲醇(1:1)1ml,固定細(xì)胞1~20min,再次以1000r/min離心:10min,去上清液,加入新固定液,吹打混勻,第3次經(jīng)1000r/mln離心10min,收集分裂象細(xì)胞。

2.制備染色體玻片將沉集的細(xì)胞加入O.2ml醋酸甲醇分散細(xì)胞,取一滴細(xì)胞懸液加到冰冷的玻片上,同時(shí)用口吹散細(xì)胞液滴,使細(xì)胞均勻分散于玻片上。同時(shí)可多制備幾張染色體玻片,待干燥后染色、鏡檢。

3.染色體計(jì)數(shù)及核型分析取染色體玻片經(jīng)吉薩姆染色后鏡檢。在顯微鏡下可觀察到多個(gè)中期分裂象細(xì)胞染色體,計(jì)數(shù)50~100個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目,并計(jì)數(shù)出細(xì)胞染色體的分布,細(xì)胞群體中分布zui多的染色體數(shù)目是染色體數(shù)。人正常細(xì)胞有46條染色體,為23對(duì)二倍體。染色體分組排列,每組染色體無(wú)增加或減少,無(wú)異常染色體。小鼠染色體為40條,不僅數(shù)目與人染色體不同,而且以頂端著絲點(diǎn)為主。人的染色體則為中央著絲點(diǎn),數(shù)目與著絲點(diǎn)位置可作為細(xì)胞系是人或鼠來(lái)源的依據(jù)。

(三)細(xì)胞DNA指紋技術(shù)檢測(cè)

    利用DNA指紋技術(shù)(DNA finger printing)檢測(cè)細(xì)胞基因多態(tài)性,對(duì)于判斷所建立的細(xì)胞系來(lái)源非常有用。細(xì)胞系的基因多態(tài)性應(yīng)與其來(lái)源的個(gè)體基因相似,所以應(yīng)保留原代組織或來(lái)源個(gè)體的血液作為對(duì)照樣品。

1.制備細(xì)胞DNA的雜交膜

(1)用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞,將消化的細(xì)胞用.PBS洗2~3次,1000r/min離心5min,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞DNA,用紫外分光測(cè)DNA含量。DNA經(jīng)EcoRI酶切,37℃處理,并取少量樣品經(jīng)瓊脂糖電泳,應(yīng)看到有大于5kb的DNA條帶出現(xiàn)。

(2)將酶切處理的DNA加入6×上樣緩沖液混勻,上樣到分析膠上,同時(shí)應(yīng)有其他已知細(xì)胞系的酶切DNA為對(duì)照,以及與分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物一起電泳(3V/cm),直到分子量際準(zhǔn)HindⅢ酶切*片段(23kb)已泳動(dòng)出一定距離(電泳17~20h),在紫外燈下照相記錄。

(3)分析膠變性后進(jìn)行Southern印跡雜交分析。將分析膠中的DNA電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,取出膜暴露于紫外線(302nm)下5min,然后放人干燥的雜交袋中保存,待雜交。

2.制備標(biāo)記M13噬菌體探針

(1)放射性同位素標(biāo)記M13:DNA取稀釋的M13噬菌體2μl與1μ1無(wú)菌蒸餾水混合于離心管中,放人沸水中2min,再放冰上5min,然后加11.4μl的緩沖液和0.5μl牛血清白蛋白,加入10μl a一[32P]一dGTP、2μl Klenow酶,混合管中的內(nèi)容物,短暫離心1次,放置溫室。

(2)純化M13 DNA探針:將放置的上述內(nèi)容物吸出,加到已平衡好的葡聚糖(sephadex)柱內(nèi),上2×40μI過(guò)柱緩沖液,收集2次400μ1緩沖液的洗出液放人離心管內(nèi),作為探針。將放有探針的離心管放入沸水中2min,移至冰上冷卻,待雜交用。

3.DNA雜交用標(biāo)記好的M13探針與細(xì)胞DNA進(jìn)行Southern印跡雜交分析。首先將轉(zhuǎn)移膜放入預(yù)熱的預(yù)雜交液袋中,置55℃振搖4h,然后移到預(yù)熱的雜交液袋中,于55℃,同時(shí)加入探針進(jìn)行雜交。次日將雜交后的轉(zhuǎn)移膜置洗液中室溫漂洗15min,共洗2次,再用預(yù)熱55%含有O.1%SDS的洗液沖洗,于55℃振搖15min。zui后用1×SSC液洗膜,置濾紙上自然晾干。用放射性檢測(cè)儀檢查膜上存在的放射性同位素,進(jìn)行放射自顯影,沖洗x線膠片。

    自顯影膠片上顯示細(xì)胞DNA的電泳帶型和組織來(lái)源細(xì)胞DNA對(duì)照的帶型等,這對(duì)于鑒定細(xì)胞種的來(lái)源和組織來(lái)源提供了非常有用的證據(jù),因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞系(除與組織來(lái)源的細(xì)胞)有*的帶型。

(四)同工酶檢查

    不同種系的細(xì)胞和同一種系不同組織之間同1二酶的表達(dá)呈多形性,酶功能雖相同,但結(jié)構(gòu)各異,正常和腫瘤組織細(xì)胞之間的同工酶也不同,因此檢測(cè)同工酶對(duì)于鑒定細(xì)胞系很有價(jià)值,常用于檢測(cè)的同工酶有核苷酸磷酸酶(nucleoside phosphorylase)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(glucose一6一phosphate dehydrogenase,G6PD)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MD)、乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase,LD)。

    同工酶的鑒定應(yīng)先收集細(xì)胞,分別提取標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞及檢測(cè)細(xì)胞的提取液,即*溶解上述細(xì)胞(細(xì)胞膜呈云霧狀),離心取上清液。制備凝膠,上樣(細(xì)胞提取液)進(jìn)行電泳,可用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠兩種方法電泳。取下凝膠,同酶試劑反應(yīng),即針對(duì)不同酶加入相應(yīng)的底物顯色,進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)細(xì)胞系的同工酶譜具有特異的帶型.與原取材組織相同,但與對(duì)照細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞比較,即可區(qū)分出人和鼠等種系的細(xì)胞來(lái)源。

(五)抗原標(biāo)記

    細(xì)胞表面抗原可作為鑒定細(xì)胞來(lái)源的重要標(biāo)志物,如上皮細(xì)胞表面特異性抗原可與正常上皮細(xì)胞熒光抗體結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面出現(xiàn)熒光,作為正常上皮細(xì)胞的標(biāo)志。也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme—linked immunosorhent assay,ELISA)檢測(cè)。

(六)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

    正常細(xì)胞的生長(zhǎng)與腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有明顯差別。正常細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)無(wú)浸潤(rùn)生長(zhǎng),不形成腫瘤;另外,在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)具有形成單層(具有接觸性抑制)、飽和密度及停泊依賴等特點(diǎn)。

 

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