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細胞培養(yǎng)基本要點
更新時間:2015-12-14   點擊次數(shù):1036次

(一)準備和安裝過濾器 

    清洗好過濾器,干燥,放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜,用布包裝好,15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好,膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中,出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾,過濾后要檢查濾膜是否完好無損。 

(二)合成培養(yǎng)基的配制

1、根據(jù)細胞目錄中的說明,按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yǎng)基干粉,用適量超純水充分溶解。

2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等,充分攪拌使之溶解。

3、 調(diào) pH至7.2左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈臺中對溶液進行濾過除菌,分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞緊瓶口。

6、 瓶口封好,4℃冰箱貯存。 

(三)小牛血清的處理 

    市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理,但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理,即通過加熱的方法破壞補體(近來也有觀點認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。

1、 將血清加熱至56℃并保持30 min,其間要不時輕輕晃動,使受熱均勻,防止沉淀析出。

2、 處理后的血清貯存于4℃。

3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質(zhì)量。 

(四)生長培養(yǎng)基的配制 

    除無血清培養(yǎng)之外,各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 

    培養(yǎng)基分裝成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞緊瓶口。 

    按如下比例配制: 基本培養(yǎng)基占80%~90%,小牛血清或胎牛血清占10%~20%。 按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL,。 

(五)凍存細胞的復蘇 

    應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度,取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。 

    在無菌臺內(nèi)將*培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內(nèi),約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細胞,置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃,使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 

(六)傳代: 

貼壁細胞:

    對于貼壁細胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱(或PBS洗1-3次)。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml,按此比例進行消化,(根據(jù)經(jīng)驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml*培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒灐?nbsp;

懸浮細胞:

    一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離心1000rpm,5min后加入*培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 

(七)凍存 

    將貼壁細胞消化后離心收集,懸浮細胞直接離心收集,以*培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1~2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

(八)注意事項 

    玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上; 

    無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上; 

    培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存; 

    消化液(pH7.8)或其它加入液,應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存; 

    培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時以上,如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌)。至少每月一次。 

    進入操作時應(yīng)注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數(shù)量較多,培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應(yīng)先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,打開后應(yīng)用燈先燒口,然后燒蓋。用完后同樣操作。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。 

 

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