蛋白質(zhì)的分離純化方法
沉淀法:原理:是使蛋白質(zhì)膠體顆粒的表面水化膜或表面電荷破壞,從而使蛋白質(zhì)沉淀。
• 鹽析法
• 有機(jī)溶劑沉淀法
• 等點(diǎn)電沉淀法
• 選擇性變性沉淀法
• 聚合物沉淀法
在生物大分子制備中zui常用的幾種沉淀方法是:
• 中性鹽沉淀(鹽析法):zui大的特點(diǎn)是環(huán)境溫和,不易造成蛋白質(zhì)變性。因此適用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。缺點(diǎn)是分辨率底,且后續(xù)處理時(shí)需要除鹽。
• 有機(jī)溶劑沉淀:分辨率高于鹽析法,但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分離純化比如多肽、寡肽。
• 等電點(diǎn)沉淀:其局限是,須事先了解蛋白的PI;且沉淀過(guò)程中可能發(fā)生變性和失活,部分蛋白等電點(diǎn)沉淀后不容易溶解,因此較少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀,但此法單獨(dú)應(yīng)用較少,多與其他方法結(jié)合使用。
• 選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀):多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。三氯yi醚是比較常用的酸變性劑,尤其在分析樣品的濃縮而不需考慮活性的條件下用得多。
• 有機(jī)聚合物沉淀:是發(fā)展較快的一種新方法, 主要使用PEG聚乙二醇作為沉淀劑,常用PEG6000和20000。它條件溫和,不易變性,且沉淀效果強(qiáng),很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺點(diǎn)是PEG除去比較困難。
根據(jù)分子大小不同:超濾法、透析法(膜分離法)、超速離心法、 凝膠過(guò)濾法(GF)也稱(chēng)大小排阻層析,是一種根據(jù)分子的大小和形狀來(lái)進(jìn)行分離的方法。不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠微孔時(shí)因遷移能力不同而被分離。利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相,(在其分離范圍內(nèi))按分子大小將樣品中各組份分離開(kāi)來(lái)。大分子先被洗脫,小分子后被洗脫。應(yīng)用:脫鹽 Sephadex G10、25,中間純化 Sephadex G200,精純 Sephacryl 、Superdex。常用填料:Sephadex系:是以氯代環(huán)氧丙烷進(jìn)行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠,經(jīng)典的凝膠介質(zhì)。Sepharose系:經(jīng)過(guò)純化的瓊脂糖,含極少的帶電集團(tuán)。型號(hào)zui多、應(yīng)用zui廣。Sephacryl系:有是丙基葡聚糖與N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺共聚而成,經(jīng)濟(jì)。Superdex系:是葡聚糖與瓊脂糖共聚而成的復(fù)合凝膠,,選擇性強(qiáng),分辨率*。
• 凝膠類(lèi)型:葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)。
• 葡聚糖凝膠:直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1,2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。
凝膠回收處理方法:將樣品*洗脫下來(lái)后,繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后,將柱下口放在小燒杯中,慢慢打開(kāi),再將上口慢慢松開(kāi),使凝膠全部回收至小燒杯中,備用。
G類(lèi)葡聚糖凝膠常用G-X代表,X數(shù)字既代表交聯(lián)度,也代表特水量。X數(shù)字越小,交聯(lián)度越大,網(wǎng)孔越小,適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大,交聯(lián)度越小,網(wǎng)孔越大,適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量,如G-25表示1g干膠持水2.5mL,G-100表示 1g干膠持水10mL,依次類(lèi)推。葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達(dá)到平衡,通常需要較長(zhǎng)時(shí)間。較快的做法是將干膠往水里加,邊加邊攪,以防凝膠結(jié)塊,然后放到沸水浴中加熱接近100℃,幾個(gè)小時(shí)就可以使其溶脹,還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。新柱裝好后,要用洗脫緩沖液平衡,一般用3~5倍體積的緩沖液在恒壓下流過(guò)柱床。新裝好的柱要檢驗(yàn)其均勻性-可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過(guò)柱,觀(guān)察色帶是否均勻下降。也可以對(duì)光檢查,看其是否均勻或有無(wú)氣泡存在。
蛋白質(zhì)的分離純化方法
凝膠用過(guò)后,有幾種保存方法:
濕態(tài)保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);
濕態(tài)保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);
干燥保存:水洗后濾干,依次用50%、70%、90%、95%乙醇脫水,再用乙醚洗去乙醇,干燥(或60~80℃烘干)后保存。加乙醇時(shí),切忌一上來(lái)就用濃乙醇處理,以防結(jié)塊
對(duì)生物樣品來(lái)說(shuō),經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類(lèi)物質(zhì)分開(kāi),如蛋白質(zhì)與鹽類(lèi),稱(chēng)作類(lèi)分離或組分離。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無(wú)機(jī)鹽。我們知道,蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D,而無(wú)機(jī)鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相,因?yàn)樗姆蛛x范圍是1000~5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻,而小分子組為全滲入,其Kd值的差可達(dá)zui大值1。對(duì)于分子量小于5000D的肽類(lèi)進(jìn)行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。
另一類(lèi)則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離,如分離血清球蛋白與白蛋白,這叫做分級(jí)分離。后者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高。下面以zui常用的葡聚糖凝膠類(lèi)為例,分別加以討論 。
葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法
新購(gòu)進(jìn)的陽(yáng)離子交換劑(如CM-Sephadex C-25)為Na型,陰離子凝膠交換劑(如DEAE-Sephadex A-25)為Cl-型,使用前要按一般離子交換劑的使用方法進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后減壓過(guò)濾,充分洗滌,再用等量0.5mol/L HCL處理,洗至中和備用。陽(yáng)離子交換劑lg約用100mL 0.5mol/L HCL浸泡20min后過(guò)濾,充分洗滌,再用等量0.5mo1/L NaOH溶液處理20min,洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑,用20~30倍量與層析時(shí)所用的同種緩沖液浸泡(但濃度要高,如0.1~0.5mol/L),再用同種酸或堿調(diào)節(jié)至所需要pH值,放置1h后,待pH值不變即可減壓過(guò)濾。
型號(hào) | 分離范圍Da | 粒徑 | 建議流速cm/h |
Sepharose 2B | 70-40,000 | 60-200 | 10 |
Sepharose 4B | 60-20,000 | 45-165 | 11.5 |
Sepharose 6B | 10-40,000 | 45-165 | 14 |
Sepharose CL-2B | 70-40,000 | 25-75 | 15 |
Sepharose CL-4B | 60-20,000 | 25-75 | 26 |
Sepharose CL-6B | 10-40,000 | 25-75 | 30 |
Sepharose 6 | 5-5,000 | 20-40 | 30 |
Sepharose 12 | 1-300 | 20-40 | 30 |
Sepharose FF 6 | 10-4,000 | 平均90 | 300 |
Sepharose FF 4 | 60-20,000 | 平均90 | 250 |
• 根據(jù)分子所帶電荷差異電泳法、等電聚焦等。離子交換層析法(IEX):原理:首先是根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電類(lèi)型(陽(yáng)離子或陰離子),然后根據(jù)其相對(duì)電荷強(qiáng)度進(jìn)行分離。PH:陰離子交換層析:蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,則要求PH>PI,但不能高于介質(zhì)功能基團(tuán)的PK;陽(yáng)離子交換層析:蛋白質(zhì)帶正電荷,則要求PH<PI,但不能低于介質(zhì)功能基團(tuán)的PK;緩沖溶液:陰離子交換層析:Tris-HCl 陽(yáng)離子交換層析:PB。帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來(lái),帶電荷量多,親和力大的后被洗脫下來(lái)。陽(yáng)離子交換劑 — 帶負(fù)電荷,與陽(yáng)離子交換;陰離子交換劑 — 帶正電荷,與陰離子交換。
常見(jiàn)問(wèn)題分析:
不吸附:緩沖溶液PH不對(duì);離子強(qiáng)度太高;
峰形不穩(wěn)或出現(xiàn)奇異峰:柱床中有氣泡或緩沖溶液不純
分辨率低:梯度太大;流速太高
前沿峰:柱過(guò)載;填充效果差;柱需再生
峰拖尾:樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉淀
基線(xiàn)隨梯度上移:鹽濃度臨近CMC
1.離子交換樹(shù)脂
2.離子交換纖維素
§ 陰離子交換纖維素 —如:DEAE-纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基
§ 陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素 一般pH>4條件下使用,具有羧甲基
3.離子交換凝膠— 分離大分子物質(zhì)
離子交換劑的選擇考慮因素:
1.被分離物質(zhì)帶何種電荷
2.被分離物質(zhì)分子的大小
大分子物質(zhì)選用凝膠,其次選用纖維素
3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境
4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)
5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量
根據(jù)疏水性不同:疏水層析(HIC)、反相色譜(RPC): 原理:是指固定相的極性低于流動(dòng)相的極性,在這種層析過(guò)程中,極性大的分子比極性小的分子遷移速度快而先被洗脫下來(lái)。一般使用甲醇、乙腈作流動(dòng)相,使得蛋白質(zhì)容易變性失活;常用于HPLC分析,與在水-有機(jī)相中穩(wěn)定的多肽和低分子量蛋白質(zhì)的分離。
蛋白質(zhì)的分離純化方法
梯度淋洗裝置
外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵,將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室,混合后進(jìn)入色譜柱。
內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。
示差折光檢測(cè)器:可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比;可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比;
親和層析(AC):
色譜技術(shù)